Nell’anno 1004 una comunità di monaci provenienti dalla Campania trova accoglienza nel monastero di S. Agata sui colli Tuscolani: erano i discepoli del venerando Abate Nilo, nato nella Calabria bizantina e quindi greco di origine e di rito, fondatore di vari monasteri.

Allontanatosi dalla Calabria in seguito alle incursioni Saracene, dopo aver vissuto a lungo in Campania nei monasteri di Valleluce e Sérperi, famoso per la sua santità, l’umile vegliardo desiderava trovare un luogo “ove radunare tutti i suoi fratelli e i dispersi suoi figli”, avendo, secondo il racconto del suo discepolo s. Bartolomeo, conosciuto “per divina rivelazione” il luogo del suo ultimo riposo.

Sui colli di Tuscolo vi erano i ruderi di una grande villa romana, forse appartenuta a Cicerone, fra i quali un piccolo edificio a doppio ambiente in blocchi di peperino (“opus quadratum”) già sepolcro di epoca repubblicana utilizzato dal V secolo come oratorio cristiano, denominato, per le finestre con doppia grata di ferro, “Crypta ferrata” (da qui Grottaferrata).

Secondo la tradizione, qui i santi Nilo e Bartolomeo videro apparire la Madonna, che chiedeva l’edificazione di un Santuario a Lei dedicato. Sul luogo, donato da Gregorio Conte di Tuscolo, i monaci cominciarono a costruire il primo nucleo del Monastero, utilizzando il materiale dell’antica villa romana.

La costruzione della Chiesa e del Monastero occupò i monaci per venti anni. Nel 1024 il santuario era completato, “bello, ornato di marmi e di pitture, ricco di sacri arredi, ammirato da tutti”. Il 17 dicembre di quell’anno il papa Giovanni XIX, dei Conti di Tuscolo veniva a consacrarlo solennemente, dedicandolo alla Madre di Dio, mentre i monaci cantavano in greco gli inni sacri che lo stesso s. Bartolomeo aveva composto per l’occasione.

Nel tempo il monastero divenne un importante centro di cultura grazie all'opera degli 'scriptores' che, seguendo l'esempio di s. Nilo, esperto amanuense, prepararono i codici in parte conservati nella biblioteca.

Dopo l'invasione delle milizie di Federico Barbarossa (1163), i monaci, rifugiatisi a Subiaco, ritornarono al monastero, poco prima della definitiva distruzione della città di Tuscolo, in questo periodo di riorganizzazione viene riportata (1230) nell'abbazia l'antichissima icona della SS. Madre di Dio.

Nel 1241 Federico II si insedia nell'abbazia, saccheggiandola. Segue ancora un periodo di lotte per il Papato durante lo scisma d'Occidente. Un periodo di tranquillità si ebbe sotto il cardinale Bessarione, il primo abate commendatario, colto umanista greco (1462).